分類

1）按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。

2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。

3）按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（***）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)。

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    如肽類、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示，因而目前在基礎(chǔ)與臨床科研中被廣泛應(yīng)用。較近幾年，分子生物學(xué)研究異?；钴S，但較終還要?dú)w到形態(tài)上來。用免疫組織化學(xué)方法對(duì)所研究的大分子分子進(jìn)行定位，進(jìn)而深入研究其功能。免疫組化技術(shù)免疫組織化學(xué)編輯染色方法1．直接法熒光素直接標(biāo)記特異性抗體（—抗）上，標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察→檢測(cè)抗原?！髅笜?biāo)抗體要顯示后鏡檢。直接法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，時(shí)間短，特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)：靈敏度低，所需抗體量大（不經(jīng)濟(jì)）。應(yīng)用：基本不用！2．間接法熒光素標(biāo)記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動(dòng)物的IgG抗體）?！@色后鏡檢特點(diǎn)：較直接法靈敏，可標(biāo)記一種抗體→鑒定多種抗原。3．非標(biāo)記Ab橋法：“橋法”是酶標(biāo)記抗體的改進(jìn)，經(jīng)過三次抗體，其二抗為未標(biāo)記橋抗體。（1）單橋法(2)雙橋法在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，可增大染色強(qiáng)度?！锾貏e提示：注意動(dòng)物種屬關(guān)系4．***法（過氧化物酶—抗過氧化物酶法Peroxidaseanti—peroxidasemethod，***法）~是橋法的改良，既先形成***復(fù)合物→抗原—抗體—抗IgG抗體—***復(fù)合物。該法簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了靈敏度。內(nèi)蒙古病理切片免疫組化檢查機(jī)構(gòu)上海免疫組化，HE染色，免疫熒光找融享生物科技有限公司。

減少或消除非特異性染色的方法  組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，較好常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結(jié)締組織成分上。有效方法是在用首先抗體前加制備第二抗體動(dòng)物之非免疫血清（1：5-1：20）封閉組織上帶電荷基團(tuán)而除去與首先抗體非特異性結(jié)合。必要時(shí)可加入2%-5%牛血清白蛋白，可進(jìn)一步減少非特異性染色。作用時(shí)間為10-20min。也可用除制備首先抗體以外的其它動(dòng)物血清（非免疫的）。有明顯溶血的血清不能用，以免產(chǎn)生非特異性染色。免疫熒光染色時(shí)，可用0.01%伊文氏蘭(PBS溶液)稀釋熒光抗體,對(duì)消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。當(dāng)然使用特異性高、效價(jià)高的首先抗體是較好重要的條件。洗滌用的緩沖液中加入0.85%~1%NaCl成為高鹽溶液,充分洗滌切片,能有效的減少非特異性結(jié)合而減少背景染色。

免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理—抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。免疫組化等病理實(shí)驗(yàn)服務(wù)找融享生物 。

陰性染色產(chǎn)生的原因有:

⑴一抗和二抗?jié)舛炔缓线m或孵育條件不妥。

⑵熒光素提前衰退。熒光素質(zhì)量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項(xiàng)。

⑶血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。

⑷抗體稀釋液PH值不合適，影響抗原抗體反應(yīng)。

⑸組織切片不平、裂片或脫片很嚴(yán)重，易引起大塊陰性著色。

⑹組織標(biāo)本不新鮮或已經(jīng)冷凍組織制成的切片中抗原易彌散，易引起本來表達(dá)的部位陰性染色或弱著色。

⑺熒光顯微鏡不會(huì)使用，激發(fā)波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤。

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定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合

該技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)領(lǐng)域開展深入研究是十分有意義的。

7、從蛋白水平檢測(cè)角度，免疫組化技術(shù)與Western blotting、ELISA的異同

1）Western blotting

蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測(cè)方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；當(dāng)然Western blotting也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核酸白、胞漿蛋白分別檢測(cè)其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位），但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。

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