m6A研究又有新手段了？趕緊來了解一下吧！欄目：研究動態(tài)發(fā)布時間：2019-08-14RNA甲基化m6A是如今的研究熱點之一,Cell上新發(fā)表了一篇介紹不使用m6A抗體的檢測mRNAm6A水平的Resource文章......RNA甲基化m6A是如今的研究熱點之一，目前主要的研究思路包括差異表達的write，reader和eraser基因分析；m6A抗體檢測全轉(zhuǎn)錄組甲基化水平；分析m6A甲基化水平變化的靶基因和下游機制研究。而在7月25日的Cell上新發(fā)表了一篇介紹不使用m6A抗體的檢測mRNAm6A水平的Resource文章，小編時間和大家分享一下。作者開發(fā)這一方法的前提是有研究報道了MazF能特異性的識別無修飾的ACA序列并發(fā)揮RNA酶活性在ACA之前剪切底物。但ACA序列的個A發(fā)生m6A甲基化之后將無法被MazF所識別，如圖一所示。圖1MazFRNA酶作用示意圖根據(jù)這一原理，作者將純化后的mRNA進行MazF酶處理，然后再對打斷的RNA進行逆轉(zhuǎn)建庫測序。對于無修飾的位點，ACA處被完全剪切，測序reads正好分布于該位點上下游而且比對至該處的上下游reads數(shù)是相同的.如圖2所示。而甲基化位點的reads會包含上下游的序列。作者開發(fā)了MAZTER-MINE軟件包專門進行分析（圖3）。由于大部分研究使用到的是人類來源的細胞，種植到免疫正常的動物體內(nèi)會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。貴州豚鼠科研技術(shù)服務(wù)培養(yǎng)

制作該模型的方法為大鼠腹腔麻醉消毒后選取腹部正中切口打開腹腔長約2cm，尋找盲腸，小心分離其遠端與大腸的系膜，在盲腸遠端1/2處用無菌4號絲線緊緊結(jié)扎，并用無菌7號針頭在已結(jié)扎盲腸遠端處貫通穿刺，然后把盲腸推回腹腔，關(guān)閉腹腔。影響因素多數(shù)研究一致認為盲腸結(jié)扎位置是CLP模型中死亡率和疾病嚴重程度的主要決定因素。結(jié)論為：①結(jié)扎25%或以下的盲腸死亡率幾乎為零，為輕度膿毒癥；②結(jié)扎50%～60%的盲腸導(dǎo)致術(shù)后死亡率為60%，為中度膿毒癥；③結(jié)扎75%或以上的盲腸導(dǎo)致小鼠在術(shù)后2～3d內(nèi)全部死亡，為重度膿毒癥。而在不同程度膿毒癥中，死亡主要集中在初的48h內(nèi)。有研究通過改變盲腸結(jié)扎位置和穿刺針直徑來調(diào)節(jié)膿毒癥的嚴重程度，其中提到與結(jié)扎長度小于1cm的小鼠相比，結(jié)扎長度超過1cm的小鼠死亡率增加至100%；增加穿刺針的直徑也使得存活率從100%（22G針）降低至55%（19G針）。結(jié)論為：在上述兩個因素中，盲腸結(jié)扎位置比針頭大小影響更為。CLP誘導(dǎo)的膿毒癥術(shù)后6h即可出現(xiàn)菌血癥，術(shù)后約12h出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)臨床癥狀，包括發(fā)熱、寒戰(zhàn)、毛發(fā)豎立、全身無力和活動減少等，術(shù)后18h開始死亡。總之，在制作CLP模型時。河北外包科研技術(shù)服務(wù)購買實驗干貨 | 常用分子生物學(xué)技術(shù)原理.

常見的有理染色、WesternBlot、PCR等），實驗儀器是否需要預(yù)約使用。如果需要外送公司檢測，需要提前聯(lián)系好商家，以及了解清楚樣本如何獲取，如何運輸。飼養(yǎng)動物及干預(yù)動物購買后需要將時間節(jié)點提前規(guī)劃好，比如，周需要做什么？測量體重？觀察飲食？測量需要的指標？中間有無特殊操作？比如灌胃、測量體重、做CT檢測、取血？……第幾周取材？取材需要哪些？預(yù)實驗方案就要提前設(shè)計清楚以上內(nèi)容。取材及樣品準備取材需要提前到動物房禁食、稱體重、取出動物、手術(shù)的、固定所需要的試劑和EP管，WesternBlot和PCR所需要的樣本儲存條件。比如凍存管、EP管，是否需要冰塊？是否需要液氮？取材當天需要多少人？是否需要請人幫忙？如果所需要取出的樣本較多，建議大家請人一起幫忙，流水線作業(yè)，這樣能節(jié)省時間，并且能保證樣品的質(zhì)量。如果請人，每個人需要負責哪一板塊的工作，比如誰負責，誰負責取血液，誰負責取，誰負責拍照、誰負責儲存，都需要提前規(guī)劃交代清楚。實驗指標檢測如果是需要自己做的檢測，比如常見的WesternBlot、PCR，建議提前可以看看教程（無論是視頻還是貼吧，都要自己多方參考）。有了一定的理論基礎(chǔ)后，再向老師、師兄師姐學(xué)習(xí)經(jīng)驗和技術(shù)。

3）基因/蛋白質(zhì)表達定性或定量檢測在進行分子檢測的過程中，保持核酸和蛋白質(zhì)的完整性至關(guān)重要，因此在取樣過程中，應(yīng)盡量避免核酸及蛋白質(zhì)的降解。如不注意采樣過程，將會導(dǎo)致樣本中的核酸及蛋白質(zhì)的無差別降解，嚴重影響后續(xù)分子檢測結(jié)果。在條件允許的情況下，樣本在離體后應(yīng)立刻裝入凍存管內(nèi)，并立即放入液氮中進行冷凍。在RNA提取樣本的保存過程中，可以選擇非冷凍型RNA保存液或Trizol試劑進行RNA酶的。針對蛋白質(zhì)提取樣本的保存，我們同樣可以使用商品化的蛋白酶劑進行短期處理。聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChnReaction，PCR）及免印跡（Westernblotting，WB），這兩種實驗手段是分子學(xué)檢測中不可或缺的一部分，也是發(fā)表至關(guān)重要的分子檢測數(shù)據(jù)。PCR主要用來對基因在基因組層面或轉(zhuǎn)錄層面的變化進行定性或定量檢測，而WB則主要用來對某一蛋白質(zhì)的表達進行定量檢測。（4）轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)檢測隨著檢測水平及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，各類組學(xué)檢測的價格降低，實驗設(shè)計中也常常運用組學(xué)檢測來提升實驗設(shè)計的檔次。在我們進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測過程中，同樣是要首先確保目標RNA或蛋白質(zhì)的片段完整性。細胞生物學(xué)是生物學(xué)的一個分支，研究細胞的結(jié)構(gòu)、功能、生理和遺傳學(xué)等方面。

轉(zhuǎn)錄組和m6A分析顯示精子發(fā)生相關(guān)基因的表達和選擇性剪接發(fā)生了改變[19]。YTHDC2可促進靶基因的翻譯效率，并降低其mRNA的豐度，在精子發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。當減數(shù)分裂開始時YTHDC2表達上調(diào)，YTHDC2敲除小鼠的生殖細胞沒有經(jīng)過偶線期的發(fā)育導(dǎo)致小鼠不育[20]。在DNA損傷反應(yīng)中，METTL3可促進DNA聚合酶κ（Polκ）與核酸剪切修復(fù)途徑快速定位到UV引起的DNA損傷位點，當缺失METTL3時，細胞無法迅速修復(fù)UV照射引起的突變，并且對UV照射更加敏感[25]。在淋巴細胞性小鼠過繼轉(zhuǎn)移模型中，Mettl3缺陷通過影響mRNAm6A修飾，降低SOCS家族mRNA衰減，增加mRNA和蛋白表達水平，從而抑制IL-7介導(dǎo)的STAT5活性和T細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)增殖和分化，進而抑制腸炎的發(fā)生[21]。在肝中，METTL14通過調(diào)控pri-miRNA的m6A修飾，影響MiR-126的生成加工，從而抑制肝的轉(zhuǎn)移[22]。在乳腺細胞中，低氧刺激能促進依賴低氧誘導(dǎo)因子HIF的ALKBH5的表達，而ALKBH5過表達降低了NANOGmRNA的m6A修飾，從而穩(wěn)定mRNA提高NANOG的表達水平，終增加乳腺干細胞所占的比例[23]。此外，低氧誘導(dǎo)乳腺細胞中依賴ZNF217的NANOG和KLF4的mRNAm6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除降低免疫缺陷小鼠乳腺的肺轉(zhuǎn)移[24]。在肺中。免疫沉淀技術(shù)是一種研究蛋白質(zhì)間交互作用的生物技術(shù)。寧夏動物科研技術(shù)服務(wù)分離

細胞的結(jié)構(gòu)是細胞生物學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。貴州豚鼠科研技術(shù)服務(wù)培養(yǎng)

必須仔細考慮所有可能影響實驗的條件和技術(shù)參數(shù)以獲得可重復(fù)且一致的實驗結(jié)果。因此，要求實驗人員深入了解和熟練掌握操作過程才能準確地構(gòu)建CLP模型。造模評價該模型通過模型動物自身引發(fā)膿毒癥，與臨床膿毒癥類似的地方在于有連續(xù)分散的細菌源，血中內(nèi)檢出率及細菌培養(yǎng)陽性率高，動物體溫降低以及血流動力學(xué)早期高排低阻晚期低排低阻的特征也與臨床相仿，在建模的同時模擬臨床膿毒癥方法，輔以充分的液體復(fù)蘇和適當輔助(如藥物)，另外這個模型可控性高，標準化水平高。該模型中膿毒癥的嚴重程度受3個重要因素的影響：結(jié)扎盲腸的長度、穿孔針的大小和CLP后的支持。結(jié)扎盲腸的長度是死亡率的主要決定因素，隨著結(jié)扎盲腸的長度的增加，促炎細胞因子的水平也在增加。來源：[1]李晗,田李均,韓旭東.膿毒癥體內(nèi)外模型研究進展.中國與化療雜志,2020,20(01):.[2]彭鳳輝,鄧曉彬,呂立文.膿毒癥動物模型的研究進展.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2020,37。貴州豚鼠科研技術(shù)服務(wù)培養(yǎng)