蛋白磷酸化檢測(cè)方法：質(zhì)譜檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)：1. 準(zhǔn)確度高，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)蛋白的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。2. 適用于大規(guī)模分析蛋白磷酸化水平。3. 不依賴于磷酸化抗體。在實(shí)際應(yīng)用中，Western Blot與質(zhì)譜分析方法各有各的好，誰(shuí)也無(wú)法完全被另一種方法所替代。所以在選擇測(cè)定磷酸化修飾的時(shí)候還應(yīng)該根據(jù)具體需要來(lái)決定。如果研究的蛋白正好有商業(yè)化的磷酸化抗體，那么lucky you，你可以選擇Western Blot進(jìn)行快速磷酸化測(cè)定研究。但是如果你所研究的蛋白質(zhì)沒(méi)有可用的商業(yè)化磷酸抗體，或是抗體價(jià)效過(guò)低，亦或是需要大規(guī)模地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白的水平的話，質(zhì)譜檢測(cè)會(huì)是更好地選擇。蛋白質(zhì)翻譯后修飾可以改變蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)。貴州蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)方法

蛋白磷酸化修飾過(guò)程：蛋白磷酸化修飾這一過(guò)程是通過(guò)蛋白激酶催化，將磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到多肽底物的絲氨酸、蘇氨酸，或酪氨酸殘基上。并且磷酸化修飾的過(guò)程是可逆的，去磷酸化反應(yīng)由蛋白磷酸酶催化完成。蛋白磷酸化檢測(cè)方法：Western Blot檢測(cè)方法：Western Blot是檢測(cè)蛋白磷酸化水平的常用方法，主要過(guò)程為先利用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后使用特異性識(shí)別磷酸化蛋白的抗體來(lái)鑒定目標(biāo)蛋白的磷酸化水平。只有被磷酸化修飾的蛋白才會(huì)在相應(yīng)分子質(zhì)量的地方顯現(xiàn)特異性蛋白條帶。浙江氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)蛋白質(zhì)乙?；揎?，顧名思義指的就是在蛋白質(zhì)原有基礎(chǔ)上面嫁接上乙?；鶊F(tuán)。

什么是蛋白質(zhì)的翻譯后修飾？蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（）是指蛋白質(zhì)在翻譯后的化學(xué)修飾。對(duì)于大部分的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，這是蛋白質(zhì)生物合成的較后步驟。PTM是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的重要組成部分。通過(guò)向修飾基團(tuán)添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或通過(guò)蛋白質(zhì)水解切割該基團(tuán)來(lái)改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)，是蛋白質(zhì)生物學(xué)功能表達(dá)的重要步驟。生物蛋白質(zhì)的翻譯后修飾極大地增加了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的類型和功能。這個(gè)過(guò)程調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄，并影響表觀遺傳學(xué)。

蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)：磷酸化蛋白質(zhì)是由蛋白激酶將ATP或GTP分子上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定的氨基酸側(cè)鏈上形成的。蛋白質(zhì)磷酸化是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞生命周期中，至少有三分之一的蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾。磷酸化修飾參與許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細(xì)胞代謝過(guò)程，且許多已知的疾病也與蛋白質(zhì)的異常磷酸化有關(guān)。因此，對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量研究，尋找差異表達(dá)的磷酸化蛋白質(zhì)，有助于發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志物和尋找新的具有診療潛力的藥物靶標(biāo)。蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)具有有效性。

質(zhì)譜分析蛋白翻譯后修飾原理：相較于沒(méi)有發(fā)生翻譯后修飾的蛋白，翻譯后修飾蛋白會(huì)在特定肽段序列有分子量的增加。在蛋白翻譯后修飾方式的質(zhì)譜分析過(guò)程中，蛋白會(huì)首先被酶切成肽段，然后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析；通過(guò)質(zhì)譜分析，得到的是一系列肽段的相對(duì)分子質(zhì)量信息。對(duì)于某一個(gè)特定的肽段而言，在沒(méi)有發(fā)生任何翻譯后修飾的情況下其序列信息和分子量是確定的，當(dāng)它發(fā)生了某種翻譯后修飾之后，例如磷酸化修飾，因?yàn)榱姿岣姆肿恿恳彩谴_定的，所以在質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)部分肽段的分子量剛好增加了一個(gè)磷酸根的分子量，則可以假設(shè)這個(gè)肽段發(fā)生了磷酸化修飾，再通過(guò)二級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜的譜圖進(jìn)行二次確認(rèn)即可實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾類型鑒定及修飾位點(diǎn)分析等。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的作用主要是改變蛋白質(zhì)的活性。浙江氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)

蛋白質(zhì)磷酸化修飾的免疫印跡技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：能夠特異鑒定單個(gè)磷酸化位點(diǎn)。貴州蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)方法

蛋白質(zhì)磷酸化修飾鑒定方法：質(zhì)譜鑒定法：在質(zhì)譜分析中，先使試樣中各組分電離生成不同荷質(zhì)比的離子，然后經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，生成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，在磁場(chǎng)的作用下，質(zhì)荷比相同的離子會(huì)被聚焦到同一點(diǎn)上，不同質(zhì)荷比的離子聚焦于不同點(diǎn)上，因此獲得區(qū)分不同質(zhì)荷比離子的質(zhì)譜圖。與未經(jīng)修飾的肽段相比，磷酸基團(tuán)修飾的肽段在相對(duì)分子質(zhì)量上就會(huì)增加79.983，由此在質(zhì)譜圖中能夠與未修飾肽段進(jìn)行區(qū)分。固相金屬離子親和色譜利用的是磷酸基團(tuán)與固相化的金屬離子有高親和力,可有效吸附磷酸化基團(tuán)，從而達(dá)到富集磷酸化肽段的效果。鰲合底物上的金屬離子通常是Fe3+或Ga3+，可以選擇性地與磷酸化肽中的磷酸部分相結(jié)合,并且在高pH或磷酸緩沖液中磷酸化肽可以釋放出來(lái)。但是這個(gè)方法不能夠有效富集不與IMAC結(jié)合的磷酸化肽段。貴州蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)方法

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