對于CAR修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)采用多種體外方法評估其胞外抗原識別區(qū)的脫靶風(fēng)險。TCR修飾免疫細(xì)胞的脫靶毒性可通過評估TCR與人體自身抗原肽的交叉識別能力來評估。首先，應(yīng)采用體外試驗測定TCR修飾的免疫細(xì)胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復(fù)合物的親和力，并說明抗原肽的選擇依據(jù)及選擇范圍。此外，還應(yīng)研究其他相關(guān)或不相關(guān)的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應(yīng)可能，應(yīng)確定靶抗原肽的較小識別基序（motif），并采用計算機預(yù)測分析評估交叉反應(yīng)性。如果計算機預(yù)測可識別出具有潛在交叉反應(yīng)性的抗原肽，應(yīng)在體外測定TCR修飾免疫細(xì)胞對表達(dá)相應(yīng)蛋白或遞呈相應(yīng)抗原肽的的細(xì)胞的識別能力。如果不能排除交叉反應(yīng)性，應(yīng)基于含有潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的蛋白的表達(dá)模式以及TCR與潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的親和力來進(jìn)行風(fēng)險評估。為獲得TCR與其他等位HLA潛在交叉反應(yīng)性的信息，應(yīng)進(jìn)行充分的HLA交叉反應(yīng)性篩選。載體拷貝數(shù)低和高有什么不同？北京基因療法載體拷貝數(shù)政策

關(guān)于整合性載體的特殊考慮如受試者接受整合性載體基因zhiliao產(chǎn)品，例如轉(zhuǎn)座子元件、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或利用整合性載體或基于轉(zhuǎn)座子的載體在體外修飾的細(xì)胞，長期隨訪中需格外關(guān)注基因zhiliao產(chǎn)品的基因組整合風(fēng)險，建議申辦方分析基因zhiliao載體在靶細(xì)胞或相關(guān)替代細(xì)胞的基因組中整合的影響如在優(yōu)勢克隆、克隆性生長是否導(dǎo)致惡性。依據(jù)載體在靶細(xì)胞基因組中整合能力的不同，可分為非整合型、定點整合型、弱整合型、隨機整合型等不同類型?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)與修飾的作用機制包括同源重組、非同源重組等。因此，需要根據(jù)多方面因素、針對不同類型產(chǎn)品的特性進(jìn)行風(fēng)險評估和控制。應(yīng)通過綜合風(fēng)險分析來論證產(chǎn)品開發(fā)的合理性和科學(xué)性，識別、確定與產(chǎn)品質(zhì)量和安全性相關(guān)的風(fēng)險因素； 確定非臨床和臨床研究期間所需進(jìn)行風(fēng)險評估的數(shù)據(jù)范圍和重點，并制定風(fēng)險防控和處理措施。申請人需在整個產(chǎn)品生命周期內(nèi)對其進(jìn)行跟蹤分析和更新，收集數(shù)據(jù)以進(jìn)一步確定其風(fēng)險特征并制定控制策略。南京上市后載體拷貝數(shù)用于檢測慢病毒載體拷貝數(shù)的方法及其應(yīng)用。

拷貝數(shù)，是指某基因（可以是質(zhì)粒）在某一生物的基因組中的個數(shù)。單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個，多拷貝則指有多個。在細(xì)菌細(xì)胞中，根據(jù)復(fù)制特性，質(zhì)粒分嚴(yán)緊型和松弛型兩類，前者在細(xì)胞中只含1?2個，而后者含10?15個以上。恒定的拷貝數(shù)與質(zhì)粒復(fù)制控制系統(tǒng)、宿主細(xì)胞遺傳背景及生長條件有關(guān)?？截悢?shù)變異(Copynumbervariation,CNV)是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的,一般指長度為1kb以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少,主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復(fù)。

利用ddPCR檢測溶液中空載體的濃度和整合到T細(xì)胞群中的CAR和TCR載體的平均數(shù)量。ddPCR檢測到的平均每個細(xì)胞的載體拷貝數(shù)與流式細(xì)胞術(shù)檢測到的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)比例呈線性關(guān)系。使用ddPCR與Real-time PCR的定量精度比較表明，ddPCR明顯更精確，測量的差異減少了7倍，文中通過一些數(shù)據(jù)的比較說明了ddPCR具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。使用ddPCR測定法通過不同的工作人員獲得了類似的載體拷貝數(shù)測量結(jié)果，突出了該測定法在技術(shù)人員之間的可重復(fù)性。對新鮮的和冷凍保存的CAR T和TCR工程改造的T細(xì)胞進(jìn)行的分析得出了相似的結(jié)果。說明ddPCR是一種準(zhǔn)確定量CAR和TCR工程T細(xì)胞中平均載體拷貝數(shù)的強大工具。該試驗也適用于其他類型的基因工程細(xì)胞，包括自然殺傷細(xì)胞和造血干細(xì)胞。慢病毒ganran靶細(xì)胞的ganran效率可以通過qPCR檢測靶細(xì)胞中的慢病毒載體拷貝數(shù)來測算。

用低拷貝質(zhì)粒作表達(dá)載體有什么好處？因為高拷貝質(zhì)粒穩(wěn)定性低，而且給宿主細(xì)胞的壓力大。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞分裂前只能復(fù)制1～2次，而多拷貝數(shù)質(zhì)?？梢栽诩?xì)胞分裂前復(fù)制成10～200拷貝。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒稱為松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)，單獨于細(xì)菌細(xì)胞而自主復(fù)制；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒一般是嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)，它們的復(fù)制隨細(xì)菌染色體的復(fù)制同步進(jìn)行。一般來說，外源基因的表達(dá)量隨拷貝數(shù)的增加而提高，但是當(dāng)拷貝數(shù)很大時，拷貝數(shù)與發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的這種關(guān)系卻不存在。細(xì)胞產(chǎn)品中的外源病毒載體基因拷貝數(shù)不高于5拷貝/細(xì)胞。浙江CAR-T載體拷貝數(shù)方法

慢病毒載體LV ， 基因載體拷貝數(shù)檢測服務(wù)，可聯(lián)系上海唯可。北京基因療法載體拷貝數(shù)政策

人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體分類：高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體，ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點。適合大量增殖克隆基因，或需要大量表達(dá)的基因產(chǎn)物。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體，由pSC101派生來的載體特點是分子量小的拷貝數(shù)。它有特殊的用途：當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時會嚴(yán)重影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致寄主菌的死亡時，就需要低拷貝的載體。失控的質(zhì)粒載體，這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。如pBEU1、pBEU2。插入失活型克隆載體。載體的克隆位點位于其某一個選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42。正選擇的質(zhì)粒載體，直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。北京基因療法載體拷貝數(shù)政策