“做miRNA下調(diào),QPCR檢測miRNA,表達水平無變化”如何解決呢?反義核酸是在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮功能,要阻斷miRNA的產(chǎn)生,理想情況是在生成成熟的miRNA之前阻斷。此要求目前唯有CRISPR / Cas9能實現(xiàn),Cas9通過在pre-miRNA序列中引入突變,從而破壞miRNA表達,是miRNA基因功能缺失研究的一種新方法。福建肖老師運用Cas9技術,針對miR-21基因設計sgRNA ,通過慢病毒遞送細胞,并在RNA水平檢測到mir-21的下調(diào)表達,從而研究出miR-21耗竭對CNE2鼻咽(NPC)細胞生物學特性及其潛在機制的影響。使用Cas9敲除miR-21之后,功能上也呈現(xiàn)出陽性,此外,溫醫(yī)大醫(yī)院的張老師使用Cas9敲除mir-545,研究了人環(huán)狀RNA PRKCI(circPRKCI)通過抑制miR-545顯示致性,促進人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的病理進展3。所以,CRISPR / Cas9對于miRNA的KO是有效的、被認可的、且以QPCR檢測表達量完全沒有問題。瑞普信生物技術有限公司第三方檢測數(shù)據(jù)靠譜嗎?血常規(guī)第三方檢測報告
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③待分離膠完全聚合后,傾去其頂部的去離子水,用濾紙將水吸干。④配制4%濃縮膠5mL,加TEMED5μL、10%APS50μL,混勻立即灌膠,灌至頂部,并垂直插入Teflon齒梳,室溫靜置20min待膠聚合。⑤待膠完全聚合后拔出梳子,將凝膠置于電泳槽中,加入電泳緩沖液,用電泳緩沖液沖洗上時間就是金錢,效率就是生命唯有惜時才能成功,唯有努力方可成就樣孔以去除氣泡。2電泳①取各個處理組蛋白提取液,調(diào)整蛋白濃度為6μg/μL,和等體積2上樣緩沖液混合,即為上樣液。②將上樣液于100℃沸水中煮沸5min,使蛋白變性,冰上驟冷,3000轉(zhuǎn)/min離心1min。③每孔加上樣液15μL,留一孔加10μL預染的Marker。加滿電泳緩沖液,蓋上槽蓋,接通電源,先用80v恒壓電泳,約20min,當指示劑溴酚藍進入分離膠后改用110v恒壓電泳,當指示劑到達距凝膠下端約處時關閉電源,取出膠板。3轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測①在電泳即將結(jié)束前,預先將PVDF膜浸泡在甲醇中15s,然后用ddH2O漂洗2min,浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5min后開始后續(xù)操作。②在水中撬膠,修膠后將膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min。③按黑面(負極)→海綿→濾紙→膠→PVDF膜→濾紙→海綿→紅面(正極)的順序制備轉(zhuǎn)膜“三明治”。瑞普信生物技術有限公司專業(yè)的第三方檢測Western Blot。
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