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一體化逆轉(zhuǎn)錄混合生產(chǎn)商

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-04-08

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉(zhuǎn)錄酶的選擇,逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行無(wú)RNA和無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的對(duì)照。多逆轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下幾種活性。①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性;以RNA為模板,催化dNTP聚合成DNA的過(guò)程。此酶需要RNA為引物,多為色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此沒(méi)有校正功能,所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高。②RNaseH活性;由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子,將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。HIV病毒復(fù)制的一個(gè)重要步驟就是逆轉(zhuǎn)錄。一體化逆轉(zhuǎn)錄混合生產(chǎn)商

逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)驗(yàn)流程:從細(xì)胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs的反應(yīng)體系中→退火,引物與RNA鏈配對(duì)→延伸,逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)cDNA鏈變性→常規(guī)PCR反應(yīng)流程(變性、退火、延伸,如此多次循環(huán))。RT-PCR“兩步法”與“一步法”RT-PCR的實(shí)驗(yàn)操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需構(gòu)建cDNA文庫(kù)(即cDNA合成與PCR反應(yīng)在同一Buffer及酶中進(jìn)行,一步法完成),省略了cDNA與PCR之間的過(guò)程。兩步法RT-PCR首先用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR,即RNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。成都cDNA合成反轉(zhuǎn)錄報(bào)價(jià)表逆轉(zhuǎn)錄引物的設(shè)計(jì)需要考慮反向引物的特性。

反轉(zhuǎn)錄酶的選擇:反轉(zhuǎn)錄酶(Reversetranscriptase)又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。是以RNA為模板指導(dǎo)dNTP合成互補(bǔ)DNA(cDNA)的酶。一部分反轉(zhuǎn)錄酶具有RNA酶活性,能夠在轉(zhuǎn)錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉(zhuǎn)錄酶沒(méi)有Rnase酶活性,可加入RNaseH來(lái)獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶。依據(jù)RT-PCR,理想的狀態(tài)下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的反轉(zhuǎn)錄酶,cDNA的合成才能在較高的溫度下進(jìn)行,確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA,并確保在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的全部活性,從而得到質(zhì)量更高的cDNA。

逆轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板合成與其互補(bǔ)的cDNA的過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù),故逆轉(zhuǎn)錄稱為RT-PCR或反轉(zhuǎn)錄PCR。逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)原理是,提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以RNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而獲得大量拷貝。逆轉(zhuǎn)錄PCR的出現(xiàn)使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí),使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):選擇合適的引物:隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的片段較小,很難得到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的cDNA。單獨(dú)選擇某一種引物,實(shí)驗(yàn)可能都不完美,具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。質(zhì)粒RNA檢測(cè)中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要特定反應(yīng)體系。

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項(xiàng),在進(jìn)行RT反應(yīng)之前,應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面:RNA:成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA,高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,如EDTA或SDS。在提取RNA的過(guò)程中,要特別防止RNase的污染,同時(shí)在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在首先鏈cDNA合成反應(yīng)中,在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入,因?yàn)閏DNA合成前的過(guò)程會(huì)使抑制劑變性,從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白R(shí)Nase抑制劑只防止RNaseA,B,C對(duì)RNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了這些抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常更換新手套。逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以進(jìn)行從RNA到DNA的轉(zhuǎn)化,從而保護(hù)RNA序列的完整性。miQP2逆轉(zhuǎn)錄試劑測(cè)序

逆轉(zhuǎn)錄后的DNA可用于構(gòu)建基因工程載體。一體化逆轉(zhuǎn)錄混合生產(chǎn)商

逆轉(zhuǎn)錄引物:加尾法逆轉(zhuǎn)錄引物的結(jié)構(gòu)并不是想象中那么簡(jiǎn)單的oligodT,其包含三個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu):①為了與PolyA序列互補(bǔ)配對(duì),OligodT序列必不可少。②在OligodT序列的5端,存在一段通用序列,用于qPCR過(guò)程中反向引物與cDNA的結(jié)合。③OligodT序列的3端存在一個(gè)或兩個(gè)錨定堿基,V或者VN。(兼并堿基,V表示A、G或C,N表示ATCG中的任意一種)。如果沒(méi)有錨定堿基,逆轉(zhuǎn)錄引物中的OligodT就會(huì)隨機(jī)結(jié)合到PolyA的任意位置,這樣會(huì)造成同一miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度不一,給較后的熔解曲線檢測(cè)帶來(lái)麻煩。因此,錨定堿基的作用就是特異性地結(jié)合到miRNA上,從而讓逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合到緊挨著miRNA的那段PolyA序列上。只有這樣,才能夠保證同一miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小相同。一體化逆轉(zhuǎn)錄混合生產(chǎn)商

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