為什么需要單細(xì)胞分辨率？生物學(xué)就像宇宙一樣。它非常復(fù)雜，有許多獨(dú)特的單體，也就是細(xì)胞。這些細(xì)胞相互作用并扮演不同的角色，在更大的體系中構(gòu)建并驅(qū)動(dòng)多個(gè)過(guò)程。就像伽利略探索宇宙的努力一樣，發(fā)現(xiàn)和定義這些細(xì)胞也需要高分辨率的工具，才能解開(kāi)促成生物學(xué)復(fù)雜性的基因表達(dá)異質(zhì)性。單細(xì)胞測(cè)序能夠在以一個(gè)細(xì)胞為功能單位中開(kāi)展生物學(xué)研究，闡明具體細(xì)節(jié)，構(gòu)建出一幅更大、更精細(xì)的圖譜，說(shuō)明導(dǎo)致產(chǎn)生某種外在表型的不同類(lèi)型的分子和細(xì)胞之間是如何相互作用的：患者為什么會(huì)復(fù)發(fā)？是什么讓這種疫苗能夠有效防止傳染等等諸多問(wèn)題。單細(xì)胞測(cè)序因其強(qiáng)大的探究疾病--細(xì)胞--基因的關(guān)系，一度成為高通量測(cè)序技術(shù)的“天花板”。廣州高通量測(cè)序單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析

二代測(cè)序技術(shù)在測(cè)序方法上取得了重大突破，基于“邊合成邊測(cè)序”（sequencingbysynthesis）和大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（massiveparallelanalysis,MPS），使測(cè)序通量和讀取速度得到極大提升，例如IlluminaSolexa測(cè)序儀。Illumina的測(cè)序原理可以簡(jiǎn)化為四步：樣品文庫(kù)構(gòu)建、簇生成、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。由于讀長(zhǎng)限制，樣品DNA或由RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA需要被打斷成300-500bp的片段，并在3和5端接上3種序列：1）Index，用于區(qū)分樣品來(lái)源；2）Adapter，用于結(jié)合測(cè)序通道上的位點(diǎn)；3）Primerbindingsite，用于結(jié)合PCR引物啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。

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關(guān)于單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)樣本制備，這與流式細(xì)胞術(shù)用戶熟悉的步驟完全一致，也就是通過(guò)酶促或機(jī)械消化、細(xì)胞分選或其他細(xì)胞分離技術(shù)從整個(gè)樣本中制備生成活的單細(xì)胞懸液。隨后是細(xì)胞計(jì)數(shù)和質(zhì)量控制步驟，以確保您的樣本有適當(dāng)濃度的活細(xì)胞，并且不含細(xì)胞團(tuán)塊和死細(xì)胞碎片。如有必要，您還可以使用抗體對(duì)樣本進(jìn)行染色，標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白或其他生物分析物，或者通過(guò)FACS來(lái)富集感興趣的細(xì)胞類(lèi)型。解離樣本時(shí)采取的具體步驟將根據(jù)您的起始材料和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)而定。也許需要額外的制備步驟，具體取決于組織質(zhì)量、樣本豐度、細(xì)胞大小，以及是否需要提取出細(xì)胞核進(jìn)行染色質(zhì)可接近性分析。無(wú)論具體的考慮因素如何，所有樣本類(lèi)型都遵循同一個(gè)基本原則，那就是生成高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液。

關(guān)于10XGenomics單細(xì)胞平臺(tái)的樣本類(lèi)型和樣本制備：10X平臺(tái)在上機(jī)前需要注意細(xì)胞消化后的細(xì)胞團(tuán)塊，獲得分離良好的細(xì)胞懸液、無(wú)細(xì)胞隨便、極少的細(xì)胞團(tuán)塊，且細(xì)胞活力高（＞70%）；此外，了解您所研究細(xì)胞的大小范圍也很重要。細(xì)胞大小通常與細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量有關(guān)。各種尺寸不同的細(xì)胞（一般直徑不大于50μm）均可與我們基因表達(dá)解決方案中使用的10XGenomics平臺(tái)兼容。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞制備方案將根據(jù)組織來(lái)源和細(xì)胞類(lèi)型而變化。每種組織類(lèi)型都是獨(dú)特的，因此，必須在開(kāi)始任何單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前優(yōu)化樣本制備，烈冰多年樣本解離消化經(jīng)驗(yàn)，累積10+物種、50+組織的消化protocol，若您的樣本為組織，且尚未成功將組織樣本消化成單細(xì)胞懸液，烈冰將盡可能提供技術(shù)及實(shí)驗(yàn)上的幫助。個(gè)性化制定測(cè)序項(xiàng)目方面，滿足從檢測(cè)基因到蛋白的多組學(xué)測(cè)序要求。

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