數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的***定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結果判讀時*判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應受擴增效率的影響**降低，對PCR反應抑制物的耐受能力**提高；數(shù)字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術也特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。轉基因食品或成分的檢測。浙江核酸拷貝數(shù)定量數(shù)字PCR
ddPCR主要有Bio-rad公司開發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應體系進行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量**的微滴中，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子。對微滴體系進行擴增反應以后，分析每個微滴的熒光信號，進行有或無的判斷，將判斷結果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標和內(nèi)參核酸的陽性微滴個數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡單，可以實現(xiàn)高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩(wěn)定性。廣東高靈敏度數(shù)字PCR共同合作可以用于白血病融合基因檢測。
數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術不同，數(shù)字PCR采用***定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到***的應用，這項技術在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、**標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面具有的廣闊應用前景已經(jīng)受到越來越多的關注。
該技術提出至今雖然只有十幾年時間，但是由于其獨特的技術優(yōu)勢和應用前景，使得其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展相當迅速。迄今為止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字 PCR 產(chǎn)品，并已經(jīng)應用于單細胞分析、**早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領域。目前，有關數(shù)字 PCR 技術的綜述類文獻并不多見，本文將在現(xiàn)有文獻基礎上，對該技術的原理、定量方法、分類及應用進行評述，并對發(fā)展趨勢進行展望。數(shù)字 PCR 技術提出至今，相關技術和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速。迄今為止，數(shù)字 PCR 技術主要有三類: 微反應室/孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。DNA聚合酶對實驗的準確性起著至關重要的作用。
從上世紀90年代以來qPCR技術的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測技術具有全新的面貌，而進入二十一世紀之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測序技術正在迅速發(fā)展，也是目前競爭**為激烈的研究領域之一，即使在這種情況下，dPCR技術仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學領域爭取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統(tǒng)的qPCR應用領域，也有一些實驗室同時選擇dPCR平臺進行平行實驗以保證實驗結果的準確和可重復性。在基因組變異研究領域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時存在，競爭性反應嚴重影響突變序列的檢測精度，數(shù)字PCR技術帶來的極高的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優(yōu)勢，在**標志物檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。近年來，Bio-Rad、凱杰、賽默飛等巨頭公司紛紛通過收購、投資等方式布局數(shù)字PCR業(yè)務。浙江數(shù)字PCR數(shù)字PCR服務
提取外泌體也是個非常費時費錢的事情。浙江核酸拷貝數(shù)定量數(shù)字PCR
拷貝數(shù)變異(CNV)研究：數(shù)字PCR直接讀取陽性信號，通過泊松分布校正得到目標基因的***拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了***的檢測精度。采用數(shù)字PCR能夠有效對二代測序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實驗結果進行驗證，并具有檢測周期短、成本低、樣本通量高等特點。低豐度DNA模板分子的精確定量：由于絕大部分微液滴中只含單個或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴增不受高豐度模板分子擴增的競爭抑制：與此同時，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過程中進行了相對稀釋，作用于單個微液滴內(nèi)模板擴增的抑制劑數(shù)量大幅降低，從而提高PCR擴增對抑制劑的耐受程度，因此可應用于諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標記物的檢測。一般而言，定量PCR的檢測靈敏度約在1%，NGS的靈敏度可達到1%，而數(shù)字PCR的檢測下限可輕松實現(xiàn)0.01%。浙江核酸拷貝數(shù)定量數(shù)字PCR