industryTemplate對(duì)模板量要求高，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致無(wú)法定量，過(guò)少會(huì)導(dǎo)致信號(hào)過(guò)低。四川數(shù)字PCR經(jīng)驗(yàn)豐富

與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對(duì)廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測(cè)方法，我們?cè)诳创龜?shù)字PCR的應(yīng)用前景時(shí)，更應(yīng)該保持一種開(kāi)放的心態(tài)，與其說(shuō)數(shù)字PCR技術(shù)是一個(gè)新的檢測(cè)平臺(tái)，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個(gè)平臺(tái)上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，其具有諸多優(yōu)勢(shì)：（1）***定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線，定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；（2）高靈敏度，可實(shí)現(xiàn)單分子級(jí)檢測(cè)；（3）高分辨率，適合在大量背景模板的干擾下對(duì)罕見(jiàn)的目標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)；（4）高穩(wěn)定性，對(duì)抑制劑的耐受程度**增強(qiáng)。憑借這些優(yōu)勢(shì)，數(shù)字PCR被廣泛應(yīng)用于多個(gè)不同的領(lǐng)域[4]，特別是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括稀有突變檢測(cè)、基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)、基因表達(dá)研究、甲基化水平檢測(cè)、**液體活檢、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)、微生物（病毒、細(xì)菌等）檢測(cè)、移植排斥監(jiān)控和二代測(cè)序輔助建庫(kù)等。此外，此技術(shù)也被用于農(nóng)業(yè)、食品安全和環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域。上海數(shù)字PCR數(shù)字PCR售后服務(wù)對(duì)干擾分子（背景信號(hào)、PCR抑制劑等）耐受度高，通過(guò)信號(hào)的“有”“無(wú)”定量而不是Ct值。

數(shù)字PCR (Digital PCR) 技術(shù)作為新一代核酸檢測(cè)和***定量技術(shù)，目前在痕量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜樣本稀有突變檢測(cè)和微小表達(dá)差異鑒定等方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可。NGS和CRISPR等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為數(shù)字PCR技術(shù)在microRNA研究、基因組拷貝數(shù)精細(xì)鑒定、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定及基因細(xì)胞***等諸多領(lǐng)域帶來(lái)了新的契機(jī)。良好的引物探針設(shè)計(jì)是數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)獲得成功的關(guān)鍵因素之一。這正是眾多研究人員選擇LNA（鎖核酸技術(shù)）的原因——LNA修飾的引物和探針采用了成熟可靠的算法設(shè)計(jì)，獲得了全世界科學(xué)家的信賴。

PCR擴(kuò)增效率的高低直接影響**終信號(hào)的判讀和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。在進(jìn)行熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需檢查樣品的密封性以及PCR反應(yīng)板是否和PCR儀熱蓋完全接觸，確保PCR過(guò)程中樣品反應(yīng)液沒(méi)有蒸發(fā)。QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)采用**的微反應(yīng)腔室封閉方式，固態(tài)的物理分割和封閉可有效避免PCR過(guò)程中微反應(yīng)體系的水分蒸發(fā)，確保微反應(yīng)體系中樣本反應(yīng)液濃度的恒定，更易實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。原始數(shù)據(jù)中往往發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)與陰性背景之間存在許多弱陽(yáng)性信號(hào)。因此需要對(duì)引物探針進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化（詳見(jiàn)引物探針優(yōu)化設(shè)計(jì)）或提升退火溫度（探針通常比引物高5~10℃），以消除疑似熒光信號(hào)的“雨區(qū)“現(xiàn)象；此外，陽(yáng)性信號(hào)和陰性背景間隙過(guò)小，導(dǎo)致**終結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確判讀。因此需要調(diào)整引物探針濃度（建議總反應(yīng)體系引物濃度為600~800nM；探針濃度為200-400nM）或5' 端**個(gè)堿基如有G出現(xiàn)，則將其互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)為實(shí)驗(yàn)所用探針，以提高陰陽(yáng)性信號(hào)間隙，便于分析結(jié)果的準(zhǔn)確判讀。一體化全自動(dòng)的QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)很大程度解放了實(shí)驗(yàn)人員的雙手，同時(shí)又避免由于手動(dòng)操作而引入的誤差。

常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)都需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于樣品測(cè)定在各種條件上不會(huì)完全一致，會(huì)造成PCR擴(kuò)增效率的差異，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而ddPCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)影響，可以進(jìn)行***定量。dPCR也有一些缺點(diǎn)，數(shù)字PCR系統(tǒng)成本高，通量有限、操作繁瑣等不足。芯片式dPCR由于芯片加工成本高，系統(tǒng)復(fù)雜度高，使得商業(yè)化優(yōu)勢(shì)不是特別明顯，特別是目前大多數(shù)分子診斷qPCR也能夠很好的滿足需求，dPCR增加的收益成本比并不算高。液滴式相對(duì)芯片式成本有所下降，但典型的液滴式dPCR液滴形成和PCR擴(kuò)增和檢測(cè)都分別在不同儀器中完成，增加了很多操作，也增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性，從這點(diǎn)上看全自動(dòng)熒光定量PCR做的更好。目前有超過(guò)130萬(wàn)條經(jīng)鎖核酸修飾的引物，提供至少3種設(shè)計(jì)方案以滿足不同跨外顯子區(qū)域的檢測(cè)需求。四川數(shù)字PCR經(jīng)驗(yàn)豐富

基因豐度非常低的，或者樣本濃度低的，可以選擇數(shù)字化PCR。四川數(shù)字PCR經(jīng)驗(yàn)豐富

CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗(yàn)證：CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功，仍需要高靈敏度的檢測(cè)方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對(duì)核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測(cè)，但精確定量評(píng)估時(shí)仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。*****的伴隨診斷：常用體液來(lái)源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來(lái)源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過(guò)微液滴處理能在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)**標(biāo)記物的有效檢測(cè)，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測(cè)、乳腺*/胃*的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)等，應(yīng)用于**精細(xì)醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。四川數(shù)字PCR經(jīng)驗(yàn)豐富