在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞凍存是**關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，尤其在細(xì)胞***、細(xì)胞存儲(chǔ)中對(duì)細(xì)胞凍存更有特殊要求，下面就根據(jù)降溫速度以及凍存液組分對(duì)細(xì)胞凍存做詳細(xì)介紹。根據(jù)降溫速度區(qū)分，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。根據(jù)凍存方式不同可以分為慢速凍存（程序降溫法）與快速凍存（非程序降溫法）。程序降溫凍存技術(shù)要點(diǎn)是慢凍，標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2/℃min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min。之前，常用的傳統(tǒng)方法是將凍存管置于4℃30分鐘--->-20℃60分鐘--->-80℃過(guò)夜--->液氮罐。不過(guò)，由于步驟較多，間隔時(shí)間又長(zhǎng)，很容易遺忘。之后，人們也開(kāi)始使用程序降溫盒。將凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃冰箱。以1℃/min的速度進(jìn)行降溫。快速凍存即不需要經(jīng)過(guò)梯度降溫，直接將細(xì)胞放入-80℃冰箱24h，后轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期凍存。快速凍存簡(jiǎn)化了凍存步驟，同時(shí)不需要使用梯度凍存盒。不同的凍存方法**了不同的凍存體系，程序降溫法使用的凍存液主要配方為培養(yǎng)基、血清、DMSO。血清大多采用牛源，同時(shí)血清中未知成分和病毒等***物質(zhì)會(huì)給凍存帶來(lái)影響與風(fēng)險(xiǎn)，該方法科研上***使用，并延續(xù)至今。無(wú)血清細(xì)胞凍存液說(shuō)明書(shū)。宿遷懸浮細(xì)胞凍存液可以放多久

    使細(xì)胞凍結(jié)中冰晶形成減少，從而避免了由于冰晶形成對(duì)細(xì)胞中生命活性物質(zhì)的一系列損傷?！?】細(xì)胞凍存時(shí)利用低溫降低細(xì)胞代謝，使細(xì)胞處于停止生長(zhǎng)的“休眠”狀態(tài)，等需要使用的時(shí)候再進(jìn)行復(fù)蘇操作。細(xì)胞儲(chǔ)存在-70℃冰箱中，可以保存一年；若儲(chǔ)存在-196℃的液氮環(huán)境中，理論上可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期永存。02細(xì)胞凍存的常見(jiàn)方法細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的關(guān)鍵要點(diǎn)是慢凍快融。細(xì)胞凍存的效果主要與降溫步驟、凍存保護(hù)液的使用、凍存溫度、復(fù)溫速率及用于凍存的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)?！?】降溫速率過(guò)快容易引起細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷，所以為防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰必須采用一個(gè)“慢”的降溫過(guò)程，并使用凍存保護(hù)劑，即凍存液。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作保護(hù)劑。根據(jù)降溫速度區(qū)分，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。傳統(tǒng)的凍存方法是將冷凍管置于4℃30分鐘、-20℃30分鐘、-80℃過(guò)夜再轉(zhuǎn)液氮。這種凍存方法步驟多，而且需要遵守幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，容易被遺忘，對(duì)于繁忙的實(shí)驗(yàn)人員而言不那么友好。而程序降溫方法，采用降溫速率-1℃～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min，再放至-196℃液氮保存。常規(guī)的程序降溫凍存方法較為復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，需要儀器設(shè)備花費(fèi)較高。細(xì)胞凍存有用嗎無(wú)血清細(xì)胞凍存液使用的是什么技術(shù)？

    有些則不需要。降溫盒須恢復(fù)室溫后再使用。根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，使用程序凍存盒凍存效果良好，沒(méi)有凍存盒的同學(xué)可以參照下文方法二和方法三。操作步驟步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來(lái)離心，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）步驟3：用配制好的凍存液重懸細(xì)胞，按照1~，擰緊管蓋，做好標(biāo)記步驟4：凍存管放入凍存盒，凍存盒放入-80℃冰箱過(guò)夜（24h）步驟5：凍存管從凍存盒取出，轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存方法二：使用無(wú)血清非程序凍存液無(wú)血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液，無(wú)需自己配制，無(wú)需降溫盒，**提升了便捷性。但是，并非所有細(xì)胞都適用于這種凍存液，使用前必須做凍存測(cè)試，沒(méi)問(wèn)題后再批量應(yīng)用。操作步驟步驟1：從冰箱拿出無(wú)血清非程序凍存液，待用步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來(lái)離心，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）步驟3：棄上清，加入適量無(wú)血清非程序凍存液，重懸細(xì)胞步驟4：按照1~，擰緊管蓋，做好標(biāo)記步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中。

    嚴(yán)禁充裝液氧等易燃易爆及腐蝕性液體，以免產(chǎn)生猛烈燃燒、或?qū)θ萜鳟a(chǎn)生腐蝕。液氮是**溫液體（-196℃），在充裝時(shí)，要穿長(zhǎng)袖工作服、帶皮手套，以避免液氮飛濺造成***。貯存容器不得作貯運(yùn)容器使用。若運(yùn)輸液氮。必須使用B型貯運(yùn)容器。因此類(lèi)容器有特殊支撐結(jié)構(gòu),堅(jiān)固可靠不易損壞。4．液氮容器在使用過(guò)程中，每天都應(yīng)隨時(shí)檢查容器的使用情況，如發(fā)現(xiàn)容器瓶蓋上和上部有水珠或結(jié)霜情況，說(shuō)明容器質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題，應(yīng)立即停止使用。5．存入取出樣品要標(biāo)記，拿取東西要輕拿輕放。一、細(xì)胞凍存方法：凍存液**好現(xiàn)配：按1：3：6（或1：2：7）配凍存液1份DMSO3份血清和6份培養(yǎng)基(養(yǎng)細(xì)胞時(shí)用什么培養(yǎng)基凍存時(shí)就用什么培養(yǎng)基)。取生長(zhǎng)狀態(tài)量好的細(xì)胞進(jìn)行凍存處理，對(duì)于貼壁細(xì)胞：1吸出舊培養(yǎng)液加PBS沖洗一次2胰酶消化3加培養(yǎng)基中止消化，有的細(xì)胞是加血清中止4離心收集細(xì)胞，不同細(xì)胞離心率不一樣（以上*為貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞收集就用第四部）5吸出離心管上清液，加1ML的凍存液重懸細(xì)胞，移到凍存管，放4度半小時(shí)，-20度兩小時(shí)，-70度過(guò)夜，再放液氮長(zhǎng)期保存懸浮細(xì)胞：直接離心收集，PBS洗滌作者：英格恩鏈接：zhuanlan./p/來(lái)源：知乎著作權(quán)歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)聯(lián)系作者獲得授權(quán)。南京翌科生物科技有限公司無(wú)血清細(xì)胞凍存液比較靠譜。

    傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液是使用培養(yǎng)基、血清和DMSO按照一定的比例混合，其中DMSO的含量10%，血清的含量是10%，統(tǒng)稱(chēng)為含血清細(xì)胞凍存液。含血清細(xì)胞凍存液的一般的凍存方法是梯度降溫凍存法，如先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘，然后移至-20℃冰箱30分鐘，再移至-80℃冰箱保存16-18個(gè)小時(shí)（或隔夜），**后才移至液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期的儲(chǔ)存。（其中需要注意的是-20℃條件下不可超過(guò)1個(gè)小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量的死亡。）可見(jiàn)，含血清細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞時(shí)遇到的問(wèn)題：1.凍存細(xì)胞時(shí)需現(xiàn)配凍存液(如購(gòu)買(mǎi)市面上通用的含血清細(xì)胞凍存液，此步可省略)2.需要程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮），步驟繁瑣，耗時(shí)耗力3.含血清，細(xì)胞污染(病毒、霉菌和支原體等)的風(fēng)險(xiǎn)更高4.血清批次、品質(zhì)間差異導(dǎo)致凍存液的批次間差異5.需液氮凍存，且不能原位（如孔板）凍存QuickFreezing-M是一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、獨(dú)特配方的哺乳動(dòng)物細(xì)胞凍存液，其化學(xué)組成明確，以DMEM為母液，含有DMSO，不含牛血清或其他蛋白成分。具有高效、低毒、無(wú)外源因子和易于使用等優(yōu)點(diǎn)，推薦用于常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存。QuickFreezing-M無(wú)血清細(xì)胞冷凍液的使用方法：1.用37℃水浴解凍細(xì)胞凍存液。無(wú)血清細(xì)胞凍存液的保質(zhì)期是多久？淮安細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞凍存液保質(zhì)期

無(wú)血清細(xì)胞凍存液應(yīng)細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)90%以上。宿遷懸浮細(xì)胞凍存液可以放多久

    進(jìn)行瓶口消毒，棄去細(xì)胞原來(lái)的培養(yǎng)基。按每25cm2/ml胰酶/EDTA消化液比例加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺(tái)內(nèi)，加入2ml細(xì)胞完全培養(yǎng)基以立即終止消化。采用無(wú)菌***頭輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有細(xì)胞懸液放入一干凈的15毫升離心管內(nèi)。配平離心：采用天平配平兩端，每分鐘800轉(zhuǎn)，室溫離心5分鐘。采用羅氏CASY-DT快速細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。加入10mlCASY-ton至以標(biāo)記viable的管子中，加入100μl細(xì)胞懸液，顛倒混勻三次，可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)?？梢?jiàn)每毫升懸液中有活細(xì)胞總數(shù)。取出凍存管，注明細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、日期。離心后，以無(wú)菌吸管吸棄上清液，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀與凍存液充分混勻，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細(xì)胞數(shù)量為每毫升有5×10?為宜。將細(xì)胞凍存懸液分裝入細(xì)胞凍存管中，一般一個(gè)兩毫升凍存管裝入1至毫升細(xì)胞凍存懸液為宜。嚴(yán)密封口后，進(jìn)行程序性降溫凍存：首先﹣4℃30分鐘，20℃30分鐘，﹣80℃過(guò)夜，**后進(jìn)行液氮保存。另有一種比較實(shí)用的降溫方法：用**少兩厘米厚的醫(yī)用棉紗將凍存管緊緊包裹，扎緊，直接放入-70℃冰箱。宿遷懸浮細(xì)胞凍存液可以放多久