具體實驗流程：注：該操作流程通常用來檢測轉染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細胞中熒光素酶表達的活性，不適用于對細菌熒光素酶進行檢測。1．實驗***天，消化并接種細胞（根據(jù)具體實驗選擇合適的細胞）于35mm細胞培養(yǎng)皿，置于5％CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。2．等細胞密度達到70％時用Luciferase報告基因質(zhì)粒、LacZ的表達質(zhì)粒及其它質(zhì)粒（根據(jù)具體實驗確定）共轉染細胞（根據(jù)具體實驗選擇轉染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。3．轉染24－36h后，吸取培養(yǎng)液，用預冷的PBS（無鈣和鎂離子）洗滌細胞。注：熒光酶的酶促反應會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉染的細胞在收集細胞前應充分洗滌除去含鈣介質(zhì)。4．在每個培養(yǎng)皿中加入350μl預冷的harvestbuffer,于4℃或冰上放置10min裂解細胞。5．在細胞裂解期間，準備足量的ml微量離心管，將ATPbuffer與luciferinbuffer以1：，每管100μl。6．依次取等體積的細胞裂解液（100μl）至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在發(fā)光儀（Luminometer）上讀取吸光值。注：發(fā)光反應會迅速衰減，將細胞裂解液加入反應液后5s內(nèi)必須讀取吸光值。7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。D-熒光素鉀鹽長期保存是有效期一年。徐州熒光素酶編碼基因D-熒光素鉀鹽試劑

    luciferin)的分子結構如右圖所示：，在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，分子結構如右圖所示，并產(chǎn)生長發(fā)生光現(xiàn)象。但是該底物熒光素以前大多依賴進口，產(chǎn)品價格昂貴。而且由于該產(chǎn)品容易降解、受潮影響使用效果。所以，需要國產(chǎn)化的方式生產(chǎn)，一方面可以降低成本，一方面可以增強使用效果。作者：科遠迪鏈接：zhuanlan./p/來源：知乎著作權歸作者所有。商業(yè)轉載請聯(lián)系作者獲得授權，非商業(yè)轉載請注明出處。D-luciferin，potassiumsalt熒光素產(chǎn)品說明書發(fā)光原理哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Fireflyluciferase基因（由554個氨基酸構成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉移、分化時,熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達?；?、細胞和活題動物都可被熒光素酶基因標記。將標記好的細胞接種到實驗動物體內(nèi)后，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(D-luciferin，potassiumsalt，以下均簡稱熒光素)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生長發(fā)生光現(xiàn)象。所發(fā)的光波長在540-600nm。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光。鎮(zhèn)江ATPD-熒光素鉀鹽使用說明D-熒光素鉀鹽使用的是什么技術？

    請穿實驗服并戴一次性手套操作。8）本產(chǎn)品只作科研用途！D-熒光素鉀鹽是熒光素酶的水溶性底物，存在于多種發(fā)光生物體中。在ATP和熒光素酶的催化作用下，D-熒光素鉀被氧化，產(chǎn)生藍綠色的光(560nm)，當?shù)孜镞^量時，產(chǎn)生的Chemicalbook光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關。編碼熒光素酶的Luc基因是植物、哺乳動物細胞的常用報告基因。由于沒有背景干擾，因此可以很容易地檢測出低至。用途D-熒光素鉀鹽是一類在生物體中發(fā)現(xiàn)的能引起生物發(fā)光的雜環(huán)化合物，如螢火蟲。在ATP存在下，螢光素酶將其氧化脫羧后會發(fā)光?；瘜W研究中可用于熒光素酶的基板。生物活性D-Luciferin是螢火蟲熒光素酶的底物。體外研究D-luciferinisthenaturalsubstrateoftheenzymeluciferase(Luc),μM.體內(nèi)研究Bioluminescenceimaging(BLI)usingthefireflyluciferase(Fluc)(5,10,15,and20min)μLofD-luciferin(intraperitoneallyorintravenously)stocksolutionpergramofbodyweight:normally~200μLfora20gmouseforastandard150mg/(eitherPotassiumorSodiumSalt)atroomtemperatureanddissolveindPBS。

    螢火蟲熒光素酶（Luciferase）是一種常用的信號分子，可以用來標記腫瘤細胞.一．細胞方法將帶有熒光素luc轉酶報告基因的真核表達重組質(zhì)粒pRc/CMV2-7，利用G418篩選，獲得穩(wěn)染人乳腺哎細胞株MCF-7-luc，并在穩(wěn)定表達熒光素酶基因的細胞克隆MCF-7體外評價其發(fā)光能力。通過建立裸鼠移植瘤模型，利用活題生物發(fā)光成像系統(tǒng)檢測腫大的瘤生長及轉移情況，為下一步監(jiān)測裸鼠移植瘤對藥物作用的變化情從而為分析藥物對腫大的瘤的治的好效果提供理想的狀況.G418篩選濃度的確定：37℃細胞培養(yǎng)箱中常培養(yǎng),G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml設置6個濃度梯度。在細胞接種24h后，加入6孔板中，每個濃度設2個孔在10～14d內(nèi)全部死亡。每天觀察細胞生長情況，死亡更低的G418濃度，即為篩選質(zhì)粒轉染克隆MCF－7細胞的濃度。1)細胞轉染取對數(shù)生長期的MCF－7細胞，將細胞接種于6孔板內(nèi)待細胞融合度達到80%～90%孔培養(yǎng)板中，TM即可轉染。按照Lipofectamine2000試劑盒操作指南進行轉染。在250μl無血清、無雙抗的DMEM培培養(yǎng)基中加入luc質(zhì)粒8μg/ml的pRc/CMV2-在250μl無血清、無雙抗的DMEM培養(yǎng)基中加入10μlLipofectamineTM2000，室溫培育5min。將上述2種稀釋液混勻。D-熒光素鉀鹽使用濃度怎么樣？

    而是對于所有能夠產(chǎn)生螢光的底物和其對應的酶的統(tǒng)稱，雖然它們各不相同。不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不同的螢光素酶來催化不同的發(fā)光反應。**為人所知的發(fā)光生物是螢火蟲，而其所采用不同的螢光素酶與其他發(fā)光生物如熒光菇（發(fā)光類臍菇，Omphalotusolearius）或許多海洋生物都不相同。在螢火蟲中，發(fā)光反應所需的氧氣是從被稱為腹部氣管（abdominaltrachea）的管道中輸入。一些生物，如叩頭蟲，含有多種不同的螢光素酶，能夠催化同一螢光素底物，而發(fā)出不同顏色的螢光。螢火蟲有2000多種，而叩甲總科（包括螢火蟲、叩頭蟲和相關昆蟲）則有更多，因此它們的螢光素酶對于分子系統(tǒng)學研究很有用。如今研究得**透徹的螢光素酶是來自Photinini族螢火蟲中的北美螢火蟲（Photinuspyralis）。[1]螢光素酶可以在實驗室中用基因工程的方法生成，并被用于多種不同的實驗。螢光素酶的基因可以被合成并插入到生物體中或轉染到細胞中。研究者利用基因工程已經(jīng)使得小鼠、家蠶、馬鈴薯等一些生物可以合成螢光素酶。間接體外成像是一種強大的研究手段，可以對整個動物體中的細胞群落進行分析：將不同類型的細胞（骨髓干細胞、T細胞等）標記上（即表達）螢光素酶。D-熒光素鉀鹽長期保存條件是-20℃干燥避光。徐州ATPD-熒光素鉀鹽

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    是新型底物開發(fā)的一個早期實例。[1]2012NanoLuc?螢光素酶基于定向進化和新型底物開發(fā)方面的經(jīng)驗，研究人員從蝦的螢光素酶改造設計出一種新型螢光素酶報告基因，即NanoLuc?螢光素酶。這是一種小分子（19kDa）單體酶，具有獨特的底物，其靈敏度比已具備高靈敏度的螢火蟲或海腎螢光素酶系統(tǒng)高約100倍。這種新型的報告基因有著范圍廣的應用前景，為進一步的技術開發(fā)奠定了基礎。[1]2015NanoBRET?技術NanoLuc?的小體積和非常明亮的光輸出是作為蛋白質(zhì)標簽的理想特征。這些特征還很適合作為生物發(fā)光共振能量轉移（BRET）的供體。一項針對各種能量受體熒光基團的深入研究發(fā)現(xiàn)，紅色光譜中的可選擇性有助于消除與BRET測定相關的一些挑戰(zhàn)?？蓪⑦@些熒光基團添加到蛋白質(zhì)配基等分子中以測量靶蛋白的結合，或與HaloTag?配基耦聯(lián)以進行活細胞中蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)相互作用的檢測。[1]2016NanoBiT?技術隨著NanoLuc?的誕生，Promega的科學家努力將該報告基因改造為多亞基系統(tǒng)，即“NanoLuc?BinaryTechnology”或NanoBiT?。該系統(tǒng)由兩部分組成：11個氨基酸的小標簽和一個更大，更精細的NanoLuc?亞基，LgBiT。這兩部分結構互補結合。徐州熒光素酶編碼基因D-熒光素鉀鹽試劑

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